1990年初，施一公赴美深造，在全美一流的约翰•霍普金斯大学医学院攻读生物物理学及化学博士学位。
施一公初到美国时，最先发现的差距就是英语不行。于是，他便给自己规定每天背诵25个新单词。科研上，他勤思苦干，持之以恒。毕业时，他的导师就曾公开宣布“施一公是我最出色的学生”。
自信心的重建，给施一公注入了一股巨大的力量，他的科研能力迅速提高。1997年4月，他还未完成博士后研究课题，就被普林斯顿大学分子生物学系聘为助理教授。此后，普林斯顿大学给他提供了面积达200平方米的实验室和近50万美元的启动基金。在当时，这样的待遇是很多人都无法企及的。良好的科研条件和机制为施一公提供了施展才华的空间。短短9年间，他就获得了普林斯顿大学最高级别的教授职位，并很快成为学校分子生物学系的领军人物。
施一公的父母要求很严格，高中和大学时候，他一直比别人更加刻苦，因此成绩也名列前茅。大学毕业时，施一公本没有打算从事科学研究，而是一心一意想下海经商，结果阴差阳错间踏上了赴美留学之路。留学的第一年，施一公情绪波动很大，无心念书，而是花了很多时间在中餐馆打工、选修计算机课程。第二年，施一公开始逐渐适应科研的“枯燥”，并有了一点自己的体会。博士第三年，施一公开始有些领会到科研的逻辑，有点儿跃跃欲试的感觉，在组会上常常提问，而这种“入门”的感觉让施一公对研究增加了很多兴趣，逐渐喜欢上了科研这条道路。
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